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  • 原中泉水对秀丽隐杆线虫活力和寿命的影响

    发布时间:2016-06-23    来源:中国农业大学动物医学院
    • 1.引 言
    • 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)作为一种模式线虫,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。该线虫自由生活、容易培养、发育期短、产卵量大、形态通体透明便于观察,所以是研究化学物质对生物活性影响最合适的模型这一。学界共识, 秀丽隐杆线虫的行为反映了生命的活力,其行为评判(behavior assay)是一个简单、敏感的生命活力检测方法。
    • 目前常用的检测方法有:
    • 1.存活率判定,这是一种可以直接观察化学物质对虫子的损伤或对虫子寿命影响的方法,即在一定时间里观察活虫的数量;
    • 2. 咽泵评判,用于记录咽部神经受化学物质的影响的情况,即在规定时间咽泵抽吸次数的计数;
    • 3.产卵评判,该虫雌雄同体,自体受精,产卵是受神经和肌肉调节的,产卵评判是某时间点上对虫卵的计数;
    • 4. 发育评判,评价从虫卵发育到固定幼虫期所经历的时间,这个评判指标可以检测化学物质对线虫新陈代谢、发育成熟的影响;
    • 5.速度评判,该线虫在固体培养基上以正弦曲线方式运动, 这种运动模式主要受其背部及腹部肌肉调节,化学物质影响运动神经导致其运动速度降低,此方法即在规定时间使用显微镜通过对虫子平板实时观察,通过worm tracker软件进行分析,计算出虫子在某时间点的速度,是一个非常好而且很敏感的活力检测方法,对药物及有毒物质尤为敏感。
    • 本研究主要通过存活率评判原中泉水对虫子寿命的影响及利用速度评判来检测原中泉水对虫子活力的影响。
    • 2. 材料与方法
    • 2.1. 实验平皿的准备
    • C. elegans在线虫生长培养基(NGM)上生长(每1L溶液中含3g NaCl,2.5g蛋白胨,17g琼脂, 1M CaCl2 1ml,1M MgSO4 1ml, 1M KPO4缓冲液25ml, 5mg/ml2 胆固醇乙醇溶液 1ml),并要饲喂大肠杆菌 OP50。实验组平皿的制备方法同 NGM培养基制备方法类似,总体积定为50ml, 用15ml试验用水溶解上面提到的物质(按比例缩减,图 1) ,高压后再加入 35ml 同一种试验水,之后制备平皿,除 2号、3 号、4 号、5 号、6 号、原中泉水及原中泉水+1 试验水外,另加设自来水对照,处理方法与试验水相同。

    • 图 1:试验培养基的配制
    • 2.2 同步虫体
    • 为保证虫子都处在同一发育时期, 虫子需要同步化处理。 虫体同步方法如下:挑取20只带卵成虫放入6cm平皿,共挑80只虫子放入四个平皿中。让虫子产卵6 个小时,然后挑去成虫,在 22°C 时培养大约 72 小时直到他们均发育为年轻的成虫。
    • 2.3 速度评判
    • 同步好的年轻成虫用M9 缓冲液(22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl及 1 mM MgSO4)悬浮然后转移到试验平皿,在 4 天时间点计算虫子运动速度,通过 USB 数码显微镜记录 20 秒(600 帧),直接用软件 ImageJ 配合轨迹分析插件wrMTrck(Jesper S. Pedersen) 分析不同平皿的虫子的运动速度。 (图2)

    • 图2:秀丽隐杆线虫对不同水质的速度检测方法
    • 2.4 寿命检测
    • 每个 6cm 平皿挑入 50 只成虫(为防止产卵,每 50ml 培养基在配置平皿前加入 16μL of 150 mM FUDR—产卵抑制剂) ,每个水质样品共挑两个平皿共 100只虫,之后把平皿移入22°C 培养箱培养,评价虫子的寿命。
    • 2.5. 数据分析
    • 通过使用Graph Pad Prism电脑软件分析,通过非配对的t检验进行数据显著性差异的分析,Bonferroni's 多重比较事后检测来分析不同组的两两比较, 寿命检测通过非线性回归拟合曲线分析在30%、50%、70%存活率时经历的时间。
    • 3. 结果
    • 3.1 原中泉水对虫子活力的影响--速度评判
    • C.elegans 以正弦曲线的模式在固体培养基上移动,这主要是由神经支配的背部及腹部肌肉协调而产生的运动效果。如图 3,4 所示虫子的运动状态及虫子的轨迹抓取效果。

    • 图 3:秀丽隐杆线虫速度检测

    • 图 4:ImageJ 配合轨迹分析插件 wrMTrck(专业软件)显示虫子轨迹
    • 速度检测实验共进行了三次,每次两个重复,如图3,4,5(压缩包中速度检测数据分析 1.pdf 及速度检测数据分析 2.pdf)。不同水样每一次检测两个使视野(相当于两个重复),每个视野大约 20 只虫 。三次实验通过软件抓取的轨迹均超过 100 只虫,2、3、4、5、6 号水样及原中泉水及原中泉水+1 组在平皿中 4天时间时检测,活力无显著差异(P>0.05) ,虽然自来水样品速度略低于其它水样,但亦无显著差异(P>0.05)。

    • 图 5:不同水质对秀丽隐杆线虫速度的影响
    • 3.2原中泉水对虫子寿命的影响--存活率判定
    • 寿命检测进行了两组试验,检测了23天。 本实验通过GraphPad Prism对存活虫数进行曲线拟合。
    • 第一组实验(如图6)
    • 拟合曲线显示在 30%存活率时,2、3、4、5、6 号水样分别处在 18.44 天,18.23 天,18.43 天,19.38 天,19.62 天,原中泉水处在 22.80 天,原中泉水+1组处于19.76天,自来水处在17.34天;
    • 拟合曲线显示在 50%存活率时,2、3、4、5、6 号水样分别处在 15.53 天,15.86 天,15.97 天,17.41 天,16.74 天,原中泉水处在 16.93 天,原中泉水+1组处于16.85天,自来水处在15.06天;
    • 拟合曲线显示在 70%存活率时,2、3、4、5、6 号水样分别处在 14.55 天,14.40 天,13.80 天,15.65 天,14.19 天,原中泉水处在 15.90 天,原中泉水+1组处于14.83天,自来水处在12.14天。
    • 从以上数据及图6可以看出:
    • 存活率 30%时,经历时间最长的三组为:原中泉水,原中泉水+1 组及 6 号水;
    • 存活率50%时,经历时长最长的三组是4号组、原中泉水及原中泉水+1组;
    • 存活率70%时,经历时长最长的三组是原中泉水、4号组,原中泉水+1组。
    • 截止到第23天时:
    • 2,3,4,5,6活虫数分别为4、5、5、5、8只;
    • 原中泉水,原中泉水+1组活虫数分别为13、7 只;
    • 自来水组活虫数为3只。
    • 23天活虫数剩余最多的三组为原中泉水,6号组及原中泉水+1组。

    • 图 6:不同水质对秀丽隐杆线虫寿命的影响 1
    • 第二组实验(如图7)
    • 拟合曲线显示在 30%存活率时,2、3、4、5、6 号水样分别处在 18.46 天, 18.49 天,19.98 天,17.72 天,17.63 天,原中泉水处在 21.24 天,原中泉水+1 组处于19.53天,自来水:无拟合数值;
    • 拟合曲线显示在 50%存活率时,2、3、4、5、6 号水样分别处在 14.89 天, 15.78 天,16.26 天,13.12 天,13.96 天,原中泉水处在 18.68 天,原中泉水+1 组处于15.99天,自来水处在14.74天;
    • 拟合曲线显示在 70%存活率时,2、3、4、5、6 号水样分别处在 13.45 天, 14.78 天,14.89 天,无,13.09 天,原中泉水处在 17.29 天,原中泉水+1 组处于 14.46天,自来水处在12.91天。
    • 从以上数据及图7可以看出:
    • 存活率 30%时,经历时间最长的三组为:原中泉水,3 号水及原中泉水+1 组;
    • 存活率50%时,经历时间最长的三组是原中泉水、3号组及原中泉水+1组;
    • 存活率70%时,经历时间最长的三组是原中泉水、3号组及2号组。
    • 截止到23天时:
    • 2,3,4,5,6号样品活虫数分别为6、3、9、3、4只;
    • 原中泉水及原中泉水+1组活虫数为9,8只;
    • 自来水组活虫数为2只。
    • 23日活虫数剩余最多的三组为3号组,原中泉水及原中泉水+1组。

    • 图 7:不同水质对秀丽隐杆线虫寿命的影响2
    • 通过两组实验数据的统计分析,存活率在 30%,50%时,各组经历时间无显 著差异(P>0.05)。存活率70%时,原中泉水组比自来水组经历时间长,并且具有 显著差异(P<0.05)。评价23日剩余活虫数,各组之间无显著差异(P>0.05)。
    • 3.3 原中泉水对虫子麻痹状态的恢复能力 为了探讨原中泉水组虫子的抗应急能力,我们额外做了一次抗应急实验。用 100ng/ml伊维菌素(使虫体麻痹的药物)作用 3h后(图8A),分别放在自来水平 皿及原中泉水平皿,经过 12 小时检测虫子速度(图 8B),自来水平皿中速度是 0.097365mm/s, 在原中泉水平皿中速度是 0.100385mm/s, 无显著差异(P>0.05) 。 (原始数据在压缩文档中)

    • 图 8:原中泉水对虫子麻痹状态的恢复能力的检测

      A:秀丽线虫作用在 100ng/ml伊维菌素 3 小时

      B: 被麻痹的秀丽隐杆线虫放入原中泉水平皿12 小时

    • 4. 结论
    • 分析结果发现,待检水样对于线虫的活性(速度)无明显的影响,建议做对 冷热等异常因素的抗应激实验。 两次存活实验结果提示原中泉水比起自来水可能 会延长线虫寿命,不过这种“可能”还需要更大量及设计更精细的实验来验证。 另外,建议进行咽泵速度,产卵率及发育速度的评判的实验,并且需要对本产品 进行不同批次的比较实验等。